健康的人类肠道菌群在5岁前的发育轨迹

健康的人类肠道菌群在5岁前的发育轨迹

通讯作者单位：瑞典哥德堡大学医学院

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实验设计

结果

图1 5岁以下儿童肠道菌群丰度及组成

我们通过增加儿童数量 (n = 471) 并跟踪他们生命的前 5 年来研究肠道微生物群的建立，从而扩展了之前的研究。我们对生命第一周 (n = 246)、4 个月 (n = 411)、12 个月 (n = 397)、3 年 (n = 336) 和 5 个年龄样本的 16S rRNA 基因 V4 区域进行了测序(n = 288) 被收集（表 1）。我们还收集了 357 名产后母亲的肠道微生物样本。我们将结果与瑞典 (S3WP) 研究中正常瑞典成年人（50-64 岁）的 101 个粪便样本进行了比较，确定了 1,434 个操作分类单位 (OUT)。婴幼儿肠道微生物群的α多样性随着年龄的增长而增加，但在5岁时，其多样性仍低于成人（p = 4.6⋅10−5；图1A）。由于母亲的肠道菌群并不代表正常的成体菌群，因此我们使用S3WP成体菌群进行进一步的分析和比较。

表 1. 研究人群的描述性数据

图 1. 与成人相比，从新生儿到 5 岁肠道微生物群的发育。 (A) 由 Faith PD 在新生儿 (n = 246)、4 个月 (n = 411)、12 个月 (n = 397)、3- 总队列 (n = 471) 中测量的 Alpha 多样性（物种多样性）岁儿童 (n = 336)、5 岁儿童 (n = 288)、母亲 (n = 357) 和瑞典健康状况分析 (S3WP) 成年人。 (B) α 多样性的纵向发展，以 Faith's PD 表示，在 35 名随机选择的儿童中以灰度（从 4M 到 5Y）测量；时间是线性混合效应模型中的一个重要因素，p

为了更好地模拟每个儿童肠道微生物群的纵向发育，我们对 213 名 4 个月至 5 岁的儿童进行了亚分析。结果表明，α多样性随着年龄的增长而显着增加，系统发育多样性每月平均增加 3.9 ± 0.1 单位 (p < 2.2⋅10−16)（图 1B）。对所有样本的加权分析表明，肠道微生物群的总体组成在不同年龄组中发生显着变化，类似于成人微生物群随着儿童年龄的增长而增加（图1C-1E）。然而，在 5 岁时，儿童肠道微生物群的组成仍然与母亲和成人存在显着差异。肠道微生物群在 4 至 12 个月之间变化最大，年龄解释了其总变异的 23%，而在 12 个月至 3 岁时仅解释了 5%，在 3 至 5 岁时解释了 0.9%。 （框图见图1C）。因此，4月龄和12月龄婴儿的肠道菌群与成人相比具有高度异质性，与成人相比差异最大，但3岁和5岁婴儿的肠道菌群与成人更为相似（图1D-1E）。

图2 4月至5岁儿童肠道动态和肠道菌群特征

为了进一步表征肠道微生物群发育的动态健康的人类肠道菌群在5岁前的发育轨迹，我们使用时程分析对 213 名 4 个月至 5 岁儿童的完整样本中微生物属的相对丰度进行分类。该分析确定了肠道微生物群发育中每个属的四个主要轨迹：(1) 4 个月时相对丰度最高的属； (2) 12个月时相对丰度最高的属； (3) 相对丰度在4～12个月内迅速增加并在3年内达到稳定水平的属； (4)属水平的相对丰度在12个月后增加，并在3至5岁时达到稳定水平。继续增加（图2A）。

图 2. 5 年肠道微生物群发育过程中微生物属的丰度。 (A) 使用混合效应模型估计纵向队列中 4 个月、12 个月、3 年和 5 年的微生物属丰度中位数 (n = 213)。 (B-E) (B) 第一基因座、(C) 第二基因座、(D) 第三基因座和 (E) 第四基因座的代表性属的例子。从(E)、(F)各时间点开始，在总队列和S3WP队列中，横向情况。

3 不同年龄段的社区类型

接下来，我们使用多项式混合物（DMM）来测试不同年龄儿童的肠道微生物群是否根据年龄聚集成不同的群落类型。我们确定了 14 个群落类型：新生儿样本中有 3 个（NB 类型 1,2,3），4 个月时有 4 个常见类型（4M 类型 1,2,3,4），有 3 个群落类型（12M 1,2， 3）来自群落类型的样本（图3A）。

图 3. 肠道微生物群通过特定年龄的群落类型而发展。 (A) 样本 (n = 471) 在 14 个已确定的群落类型中的分布（y 轴）。 (B) 区分属（行）的群落类型相对丰度的热图，按其所属轨迹排序。 (C) 分布在 14 种群落类型中的 alpha 多样性箱线图（以 Faith 的 PD 衡量）。 (D) 在具有完整系列样本的队列中切换群落类型 (n = 213)。

正如预期的那样，在每个年龄阶段，总体群落结构以属为主，具有各自的殖民和建立轨迹。具体而言，新生儿和4月龄婴儿的群落类型与轨迹1一致（图2B），12月龄时的群落类型与轨迹2和3一致，3岁和5岁时的群落组成一致具有轨迹 3 和 4（图 2B）。图 3B）。

与5岁儿童相比，成人群落的属水平细菌丰度更高。正如预期的那样，并且与图1A中的数据一致，α多样性最低的群落类型以新生儿为主，而α多样性最高的群落类型以成人为主。在同一年龄组的样本中也观察到群落类型之间α多样性的差异。进一步分析发现，按α多样性划分的群落类型为12M，α多样性最高的群落类型为12M3，其中和未分类瘤胃球菌的丰度较高，且该群落类型中瘤胃球菌的丰度也较高。低的。此外，3岁和5岁儿童的群落类型通过普氏菌、双歧杆菌和拟杆菌的丰度差异进行区分。

4. 肠道菌群发育成成人群落

为了进一步研究发育轨迹，我们对全系列样本的子队列 (n = 213) 进行了类似的分析。 12 个月时的 Alpha 多样性与 5 岁时的 Alpha 多样性呈正相关（相关性，rho = 0.32，p = 1.5⋅10−6）。 Child 12M 型群落类型的多样性随着时间的推移而减少，而 Child 3 型群落类型的多样性随着时间的推移而增加（图 3A）。但也有少数儿童在5岁时群落类型相对不成熟，即其微生物群具有12M特征的群落类型。这些儿童的部分肠道微生物群在3岁时也被分类为12M群落类型，这表明儿童肠道微生物群的发育轨迹中存在个体动态，但没有微生物群随着时间的推移而降低其α多样性。性别。在 4 个月至 5 岁儿童的微生物群发育轨迹中（图 3D），我们确定了最常见的轨迹。

5 与成人和发育中肠道的α多样性相关的细菌

由于我们观察到α-多样性与细菌成熟密切相关，因此我们接下来研究了哪些细菌与不同年龄的α-多样性相关。在12M型样本中，几个与多样性增加相关的OTU属于粪杆菌属，其他几个属于未分类的梭菌属物种，与直肠真杆菌具有较高的识别度（图4A）。有趣的是，所有年龄段属于瘤胃球菌的 OTU 与 α 多样性呈负相关，并随着时间的推移而减少，导致成人微生物群丰度显着低于 5 岁儿童（图 4 B），我们进一步将瘤胃球菌鉴定为儿童和成人未成熟菌群的标志。

图 4. 与低群落丰度相关的 OUT 在儿童和成人微生物组中是一致的，在所有年龄段的低多样性群落类型中都增加。 (A) OTU 的热图与时间点内的群落丰富度显着相关。 (B) 不同年龄OTU的相对丰度。 (C) 不同年龄群落类型中瘤胃球菌 ( ) OTU 的相对丰度分布。 (D) 12 个月 (12M) 时三个体重增加发展组之间的群落类型分布。 (E) 12 个月时具有较低（低，12M1+12M2）α 多样性和较高（高，12M3，Child 1,2,3）α 多样性的三个体重增加发育组的群落分布。 。 (F) 使用秩和检验校正错误发现率后，高组（群落类型 12M3 和）与低组（12M1 和12M3）绘制了水平热图。

6 肠道菌群与生长发育的关系

接下来，我们研究了该队列中 1200 万微生物群的组成如何影响儿童在未来 4 年内的体重发展。与体重正常或较快体重社区类型的儿童相比，12 个月时体重增长慢于预期的儿童（定义为基于 12 个月至 5 岁之间的生长参考曲线的变化 > -0.67 标准差分数 (SDS)）（ 12M1 和 12M2）的多样性较差（图 4D 和 4E，测试；p = 0.028，比值比 1.99，95% CI (1.03–4.04)）。在多样性较低的细菌群落结构（群落类型12M1和12M2）中，未分类的瘤胃球菌、粪杆菌和酵母菌的相对丰度低于成熟微生物组中的相对丰度（图4F），表明这些群落是更加多样化的微生物群标记，与正常体重增加有关。

影响肠道菌群早期生活方式的7大因素

我们研究的纵向设计可以调查早期生活因素如何影响 5 岁时的微生物群。我们和其他人之前已经证明，分娩方式对一岁以下儿童的肠道微生物群有深远的影响。在这里，分娩方式对新生儿和婴儿肠道微生物群的组成和群落类型以及4月龄新生儿群落类型之间的转变有很大影响（图5A）。

图 5. 给药方式对肠道菌群的影响可持续长达 5 年。 (A) 新生儿 (NB) 和 4M 集落类型 (n = 227) 的出生模式频率和时间点之间的转变。 (B) NB、4M 和 12M 菌落类型的出生模式频率和时间点之间的转换 (n = 347)。 (C) 12 个月时顺产和剖腹产儿童处于“低”和“高”社区类型的频率。 (D) 社区类型“低”和“高”的儿童在 12M 时间点的 Alpha 多样性。 (E) 根据出生方式在每个时间点在 PD 中测量的 Alpha 多样性。 (F) 5 岁时阴道分娩和剖腹产儿童的社区类型频率。

我们观察到α多样性较低的群落类型（12M1和12M2）中4个月和12个月菌落类型之间的出生特异性转换模式和较高的剖腹产率（精确检验，p = 0.0005，图5B-5D）。然而，无论是剖腹产婴儿（精确检验，p = 0.65）还是顺产婴儿，从 4 个月时的特定群落类型到 12 个月时的低多样性群落类型的转变没有显着的过渡代表性（精确检验，p = 0.65）。精确测试，p = 0.12；图 5 B)。在使用所有样本的横断面比较中，剖腹产婴儿的α多样性在4个月时较低，但在3岁时趋于正常，在5岁时甚至更高（图5F）。因此，5 岁儿童中“成人”社区类型的数量在剖腹产儿童中所占比例过高（检验，p = 0.039，图 5F）。我们还观察到剖腹产婴儿和顺产婴儿之间 25 个属的相对丰度存在显着差异。

讨论

在这项研究中，我们描述了 471 名正常瑞典儿童从出生到 5 岁的肠道微生物群的发育情况，延续了之前的研究，即儿童 5 岁时肠道微生物群已具有成人样的结构。 ，但其丰富度仍然较低，并且成人肠道中存在的一些关键细菌群被遗漏。我们的研究结果强调了微生物群在早期建立过程中可能对干扰因素特别敏感的可能性，这可能对以后的健康产生深远的影响。

我们在 3 岁以下的每个时间点观察了特定年龄的微生物群类型，证实了肠道微生物群在生命最初几年的显着发展。当儿童开始吃固体食物时，会出现更复杂的微生物组，与成人常见的菌群相关并定义为轨迹 3。断奶后，甲烷短杆菌等产甲烷菌的丰度首先增加（等人，1989），这与与我们的发现。此外，甲烷短杆菌属和脱硫弧菌属是氢气消耗者，并沿着轨迹4定殖，这可以通过减少抑制发酵过程的氢气量来增强发酵潜力。

正如之前在 3 岁儿童和学龄儿童中观察到的那样，我们发现了 3 岁和 5 岁的拟杆菌、普氏菌和双歧杆菌的群落类型存在差异。然而，通过将成年人纳入我们的聚类分析，我们不仅发现少数 5 岁儿童与成年人聚集在一起，表明他们的肠道微生物群相对于他们的年龄更加成熟，而且还发现一些成年人的微生物群比他们成熟。年龄预期更加不成熟。来自不同细菌的 OTU 与 12 个月、3 年、5 年和成年时的 α 多样性相关。高α多样性与几种未特指的梭菌目、甲烷短杆菌、以及R.的丰度较低有关。这与R.的丰度随时间减少的结论一致。

与营养不良儿童相比，营养不良儿童的微生物群还不成熟。我们的研究中没有包括临床营养不良的儿童，但据观察，在 12 个月至 5 岁时体重增长低于预期的儿童在 12 个月时的肠道微生物群更加不成熟，尽管比马拉维临床营养不良的儿童要多得多和孟加拉国。然而，与营养不良的儿童类似，体重增加较低的瑞典儿童的粪杆菌和瘤胃球菌类群的丰度也有所减少。重要的是，因为我们的结果是基于相对丰度，所以我们不能排除特定类群丰度的明显增加或减少可能是由于改变儿童粪便样本中总细菌负荷的因素造成的。

有大量文献探讨了分娩方式对出生后第一年肠道微生物组成的影响。此外，分娩方式也可能与过敏和肥胖的发生有关，可能是通过影响出生后免疫系统发育过程中关键窗口期的微生物组来实现的。与此相一致的是，我们在已发表的文献中发现，分娩方式对生命早期的肠道微生物群有很大影响，尽管它仍然可以显着解释 3 岁和 5 岁时肠道微生物群组成的变化。 ，但这种影响很小。剖腹产与 4 个月时较低的 α 多样性相关，这与之前的观察结果一致。我们还观察到，在剖腹产出生的儿童中，当他们在 12 个月大时处于微生物群的过渡阶段时，他们的 α 多样性较低，并且大多数为该类型。然而，随着肠道微生物群的不断成熟，这些差异会正常化。未来，需要更大规模的研究来确定肠道微生物群可能对疾病发展特别敏感的潜在发育窗口。此外，利用扩增子序列变异对先前发表的数据集进行重新分析和荟萃分析可以促进独立于参考数据库的重要分类群的识别。

综上所述

在这项研究中，我们使用纵向出生队列来描述人类肠道微生物群在生命前 5 年的发展。我们的结论是，一些与人类健康相关的微生物群类型是在儿童晚期获得的，到 5 岁时尚未达到成人肠道中的水平。此外，我们观察到正常人群中儿童的肠道微生物群沿着微生物群的发育轨迹以个体速率发育，因此强调了考虑微生物群动态的重要性。

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