重组腺相关病毒基因治疗产品的研究进展与挑战

重组腺相关病毒基因治疗产品的研究进展与挑战

［摘要］与其他病毒载体相比，重组腺相关病毒（rAAV）载体具有感染性强、目的基因可持续表达、无致病性、非基因组整合等优点，已成为体内基因检测的首选方法。治疗。主要病毒载体。目前，国际上已有3个rAAV相关基因治疗产品获批上市，超过200个候选药物正在进行临床试验。然而，国内行业在开发临床应用级rAAV产品时面临诸多挑战，监管部门也缺乏此类产品药学评价的实际审评经验。为此，本文总结了rAAV基因治疗产品的最新研究进展，并从原料、生产工艺、质量控制等方面探讨了该类产品药学评价的考虑要点，以期促进rAAV基因治疗产品的研究进展。此类产品的临床转化及应用。

[关键词] 重组腺相关病毒；基因治疗；药学评价；生产技术；质量控制

[来源] 药学杂志 2020

【作者单位】刘伯宁、徐龙昌、韩冬梅、罗建辉（国家药品监督管理局药品审评中心）

基因治疗产品通过将外源基因引入靶细胞或组织中，对特定基因进行替换、补偿、阻断或修饰，从而达到治疗疾病的目的[1]。根据引入靶基因的方法，可分为以嵌合抗原修饰的T细胞产物为代表的体外治疗（ex vivo）和以病毒载体为代表的体内治疗（in vivo）。与其他病毒载体（逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等）相比，重组腺相关病毒（rAAV）载体结构简单，无致病性，可感染分裂期细胞/非致病性细胞。 -分裂细胞等显着优势。目前国际上已批准上市的病毒体内基因治疗产品如、、、、等均采用rAAV载体。同时，还有超过200个rAAV候选药物处于临床研究阶段[3]。

近一年来，国内多家企业已开展rAAV基因治疗产品的临床试验或按照“药”申请进行注册申请前的沟通。然而，与以细胞为载体的体外基因治疗产品相比[2,4]，国内病毒载体基因治疗产品相关技术指南的制定和发布相对滞后[1,5]，监管部门缺乏相关信息。实际产品。回顾经验。本文结合国外rAAV基因治疗产品的最新研发进展和已上市rAAV产品的综述实例，探讨该类产品的药学研究内容和评价要点，以期促进国内同类产品的注册申请和临床转化。

1. rAAV基因治疗产品研发进展及评价难点

1.1 rAAV用于体内基因治疗的显着优势

AAV是一种无包被的细小病毒，具有二十面体结构，大小为20至26 nm。 AAV 最初被发现是腺病毒的污染成分。它是一种天然复制缺陷型病毒。它只有在辅助病毒（腺病毒、疱疹病毒）存在的情况下才具有复制能力。对人体也无致病性，具有良好的生物安全性。 AAV含有4.7 kb的单链DNA基因组，其中包括编码病毒复制和整合相关蛋白的rep基因、编码衣壳蛋白的cap基因和编码辅助激活蛋白的app基因。根据衣壳蛋白的差异，AAV可分为12个血清型和100多个变种。不同血清型对人体不同组织具有不同的靶向特性和感染效率。例如，AAV8对肝组织细胞的感染效率较高，而AAV1和AAV9分别对心脏细胞和骨骼肌细胞更敏感。与其他病毒载体相比，由AAV修饰的rAAV载体具有结构简单、无致病性、可以感染分裂/非分裂细胞、且不整合到基因组中等优点。它们目前广泛用于基因治疗。病毒载体之一。目前，rAAV2最常用于临床试验，而rAAV9可以穿过血脑屏障，可用于治疗中枢系统疾病[3]。

1.2 rAAV基因治疗行业发展现状

据不完全统计（网页链接-tors.php），目前至少有238个rAAV基因治疗产品正在进行临床试验，其中3个rAAV基因治疗产品已在欧洲和美国注册上市（表1）[6、 7]。 rAAV基因治疗产品的适应症主要集中在单基因遗传病领域，包括血友病、杜兴氏肌营养不良症、先天性黑蒙、脂蛋白脂肪酶缺乏症和阿尔茨海默病等。与传统替代疗法[8]相比，rAAV产品在基因水平上进行修复，单次给药即可达到长期效果。近年来，全球不少传统制药公司通过并购方式进入这一领域，如 and Inc、 and 。在我国，2003年第一个基因治疗产品“重组人p53腺病毒注射液”上市后[9]，基因治疗行业的发展长期陷入低谷。不过，近年来，药审中心陆续收到国内多家企业开展rAAV产品临床试验的通讯申请。

1.3 rAAV基因治疗产品药学评价的内容和难点

与工艺研究成熟、质量表征充分的重组蛋白产品相比[10-12]，rAAV产品的药物开发和评价存在许多挑战。例如：在原材料方面，病毒包装细胞和培养基中的动物源性成分可能受到外源因素的污染；当永生化细胞或肿瘤细胞系用作生产细胞基质时，存在癌基因转移的风险。在生产技术方面，目前广泛采用的多质粒瞬时转移工艺，批次间一致性较差，产能放大有限。如果使用辅助病毒进行生产，则最终产品中存在病毒污染/残留的可能性。在质量研究方面，病毒颗粒中含有多种复杂的产品相关杂质（空病毒、DNA包装错误的病毒、非感染性病毒等），在质量控制上很难通过单一项目来控制产品纯度。效价分析方法需要反映靶基因的转移、表达和功能。分析方法开发困难，自制标准品稳定性差。上述问题都对rAAV基因治疗产品的药学研究和加速审评提出了挑战[13]。

目前，国内外尚无针对rAAV基因治疗产品的具体技术指南。主要基于审评实践的技术指导原则仍然是2003年3月发布的《人类基因治疗研究及制剂质量控制技术指导原则》[5]。此外，2020年版《中国药典》即将增补的《人用基因治疗产品通则》将对病毒基因治疗产品的生产和质量控制提出通用技术要求[1]。国际上，欧盟EMEA于2018年发布了《基因治疗产品质量、非临床和临床试验指导原则》[14]，美国FDA也发布了《人类基因治疗临床试验应用药物信息》 ”[15]等6条基因治疗指导原则。上述指导原则和技术文件将成为今后此类产品药学评价的主要技术依据。

2 AAV基因治疗产品的药学研究内容及评价注意事项

下面将结合rAAV基因治疗产品的研发进展，重点介绍其原料、生产工艺和质量研究的药学研究内容和评价考虑。

2.1 原材料相关研究内容及评价

2.1.1 病毒分子设计

rAAV的载体设计应以临床有效性和安全性为基础，一般针对特定组织或细胞，删除与毒力、致病性或复制能力相关的基因，以保证产品的安全性。同时设计时要考虑载体基因组大小、包装效率、表达效率，尽量减少与体内相关病毒的同源性，避免形成复制型病毒。构建病毒质粒时应考虑引入抗生素抗性基因的风险，一般不允许使用氨苄青霉素抗性基因。

2.1.2 细胞基质的制作

目前，业界用于生产rAAV的细胞基质包括哺乳动物细胞（BHK）、人类肿瘤细胞系（HeLa、A549）和昆虫细胞系（SF9）。应充分表征包装细胞并构建文库。鉴定项目一般包括鉴定、纯度、基因型/表型、致瘤性/致瘤性、遗传稳定性和引入序列等。除常规无菌、真菌、支原体外，还应特别关注细胞基质中的种属特异性病毒。例如：应检测细胞的 CMV、HIV-1/2、HILV-1/2、HH-V6/8、JV 病毒、BK 病毒、EBV、B19、HBV、HPV 和 HCV [16]；应检测 SF9 细胞 昆虫病毒，如螺原体和弹状病毒 [15]。使用人肿瘤细胞系作为包装细胞时，应充分评估致瘤性和致瘤性的风险，以及致癌病毒的感染。例如：HeLa细胞是源自人类宫颈癌组织的肿瘤细胞，已知含有50个拷贝的HPV-18基因组和病毒E6/7基因序列。因此，建议在质量控制项目中检测转移基因残基[17,18]。

2.2 生产技术相关研究与评价

2.2.1 AAV产品上游流程

2.2.1.1 多质粒瞬时转移法

最早的rAAV生产过程使用质粒和辅助病毒来感染包装细胞。目前普遍采用三质粒共转HEK 293生产工艺。细胞含有腺病毒（AdV）的E1a和E1b基因，以及转移质粒（含有目的基因和ITR序列）、结构质粒（含有rep/cap基因）和辅助质粒（复制病毒基因E2A、E4、VARNA）等），rAAV可在48至72小时后重组包装。该方法适用于rAAV多种血清型，发酵产量一般可达到1014 VG/ml（ ），一般可以满足早期临床试验的rAAV用量（1016 VG）。

2.2.1.2 稳定生产细胞法

可以构建含有辅助基因rep/cap和目的基因的稳定转导的HeLa细胞系，腺病毒感染后也可以包装rAAV病毒[17]。尤其是使用可悬浮培养的HeLa S3细胞系，稳定转导的细胞生产方法可直接放大至2,000 L规模。同样，构建了含有ICP27基因的BHK细胞，并用含有辅助基因和靶基因的复制缺陷型d27.1 HSV转染，也能高效表达rAAV[19]。然而，稳定细胞转染方法的主要缺点是细胞构建和遗传稳定性研究耗时，且生产过程中使用辅助病毒存在病毒安全风险。

2.2.1.3 杆状病毒感染昆虫细胞方法

杆状病毒具有高度物种特异性，不感染脊椎动物，并且可以将rAAV基因和辅助功能的反式作用元件转移到SF9昆虫细胞中。因此，近年来也开始应用于rAAV的规模化生产。该方法的优点是杆状病毒生物安全性好、感染效率高、生产工艺易于放大。然而，在质量控制项目中也应考虑杆状病毒和DNA相关物质的残留[20]。

对于rAAV的上游生产工艺，药学评价建议重点关注工艺开发和关键工艺验证。例如，在使用多质粒瞬时转染或添加辅助病毒时，应通过工艺开发和验证来说明关键工艺参数和中间接受度的控制范围。标准，如不同的载体配比、转染试剂用量、辅助病毒和生产细胞的感染复数等[1,14,21]。

2.2.2 AAV产品下游流程

2.2.2.1 纯化工艺

rAAV纯化过程一般包括细胞培养基的收获、细胞的化学/物理裂解、酶消化去除核酸物质、多步层析和密度梯度离心、更换制备缓冲液等。其中，亲和层析模拟细胞应激对细胞的影响。机体的结合作用捕获rAAV。例如：硫酸肝素填充剂可以特异性结合rAAV2，AVB琼脂糖填充剂可以结合rAVV 1、2、3、5和8等多个血清型[22]。为了去除空载体，目前使用碘克沙醇和氯化铯超速离心方法。值得注意的是，《中国药典》相关通篇[1]明确规定“除非另有正当理由，氯化铯-溴化乙锭密度离心法不得用于基因治疗产品的纯化”。

2.2.2.2 病毒清除验证

如上所述，当使用杆状病毒昆虫细胞或稳定转导细胞系（HeLa）生产工艺时，会使用杆状病毒或辅助病毒（HSV、Ad5等）。因此，应在下游过程中添加特定的病毒去除/灭活步骤。例如：使用表面活性剂 X-100（0.5%，v/v）并添加病毒过滤过程，去除收获液中残留的杆状病毒；采用添加表面活性剂、低pH灭活等工艺去除HSV病毒；采用离子交换法、短时间加热（52℃、10min）、纳滤去除腺病毒[23]。

2.2.2.3 制剂处方

由于rAAV衣壳蛋白对温度和pH变化不敏感，因此rAAV产品的制剂开发相对简单。通常习惯在盐溶液中添加200 mmol·L-1硫酸镁或0.001%泊洛沙姆F68以避免聚集体的产生，基本可以支持长期储存（-65℃）和运输稳定性。

对于rAAV下游生产工艺，药学评价建议根据产品相关杂质和工艺相关杂质的去除效率来评价纯化工艺的合理性和稳健性。对于使用辅助病毒的生产工艺，应根据收获液中的病毒含量验证病毒去除/灭活工艺，并综合评价病毒的残留安全性。

2.3 质量控制相关研究与评价

2.3.1 相关杂质研究

2.3.1.1 工艺相关杂质

rAAV 产品中与工艺相关的杂质包括宿主蛋白、宿主 DNA、辅助病毒、质粒、血清和病毒包装和纯化过程中引入的氯化铯等成分。因为病毒包装细胞通常含有癌基因，如细胞中含有E1A的腺病毒基因，HeLa细胞中含有E6和E7癌基因。因此，一般宿主细胞的残留DNA含量应小于10ng/Dose，残留DNA片段应小于200bp[24]；

2.3.1.2 产品相关杂质

rAAV产品中的相关杂质包括基因未包装的空病毒、基因包装错误的病毒（宿主DNA、不完整的靶基因、辅助病毒基因等）、无感染活性的病毒颗粒、聚集或氧化的病毒颗粒等。这些产品-相关杂质不仅不能实现靶基因在靶细胞中的表达，在临床上还会引起免疫原性或基因毒性。例如：在多质粒正向转移系统中，空病毒的比例一般可以达到50%～98%[25]。空病毒不具备感染能力，容易形成病毒聚集体并降解，引起体内免疫反应。因此，在质量研究中应采用A260/A280、透射电镜、分析离心和质谱等技术来检测空病毒含量[24]。

复制型腺相关病毒（-AAV，rcAAV）是rAAV病毒同时包装rep、cap/AAP等基因后，发生同源/非同源重组后产生的产物相关杂质。 rcAAV 可以在辅助病毒存在的情况下复制和扩增。 rcAAV的检测一般使用敏感细胞在辅助病毒存在的情况下进行扩增。细胞裂解物经过多次扩增和传代后，通过印迹和 qPCR 确定rep或cap基因[25]。例如：已进入临床试验的rAAV产品/8-LP1-采用qPCR方法将rcAAV含量限制控制在1/2.25×106以下[26]。也有报道采用优化的多质粒瞬时转染技术，rcAAV含量限制可低于1/108 VG [16]

2.3.2 一般质量控制项目

rAAV病毒生产质量控制包括过程控制和最终产品放行测试（表2）[16,23,24,27]。例如：用于病毒包装的质粒应进行鉴定、含量、纯度、宿主细胞DNA残留、转染效率、细菌内毒素、无菌等质量控制；病毒收获液应控制外源因素（无菌、支原体等）、外源病毒、目标病毒等的检测； rAAV原液及制剂放行项目一般包括外观、理化性质（pH值、渗透压）、病毒滴度（物理滴度、感染滴度）、纯度（蛋白纯度、吸光度比、宿主DNA残留量、质粒DNA残留量、核酸酶残留）、效力（靶基因表达、体外活性、体内活性）、安全性（内毒素、无菌、rcAAV）[27]。此外，对于眼用rAAV制剂，内毒素含量不应高于2.0 EU/剂/眼或0.5 EU/mL，不溶性颗粒物应按照眼科制剂（USP）进行控制，产品放行测试应包括配方产品等[28]。

2.3.3 效价测定方法

rAAV产品的效价测定方法应反映其病毒的物理滴度、感染活性和生物活性。一般在临床试验初期，可采用qPCR方法测定病毒基因组，采用敏感细胞或靶细胞测定其感染能力和目标产物表达能力，以表征产品功效。重点临床试验开展后，应进一步发展反映产品作用机制的体外酶活性方法或体内功能实验方法。例如：SPK-RP65进入Ⅸ期临床试验后，通过测定转染指示细胞（-LRAT）后RPE65蛋白酶促进反应产物视黄醇的含量来计算产品功效[29]。值得指出的是，qPCR测定病毒基因组时应使用线性DNA绘制标准曲线。如果使用超螺旋DNA作为参考材料，载体基因组含量的测量值将明显高于真实值[16]。

3 rAAV基因治疗产品药学评价实例分析

目前，全球仅有三种rAAV基因治疗产品（、、、）获批上市。这些国内产品大多处于研发的早期阶段。行业和监管机构都缺乏rAAV基因治疗产品的药物研究和评价的实践经验。下面拟结合国外上市产品审评报告披露的信息，探讨该类产品药学评价中需要考虑的要点和常见问题。

3.1

（，AAV1-）是该公司开发的携带人类基因的rAAV2型基因治疗产品。临床用于肌肉注射治疗成人脂蛋白脂肪酶缺乏症。该产品工艺开发过程中发生了重大工艺变化：第一代生产工艺（AMT-010）采用表达系统，商业化生产工艺（ATM-011）采用杆状病毒-昆虫细胞系统进行表达。因此，进行药物和非临床可比性研究。在下游工艺中，采用工艺规模缩小模型对包膜病毒和非包膜病毒的去除能力进行工艺验证。质量研究对连续 3 个生产批次进行了全面的表征研究，包括： 成分（基因组完整性/大小、蛋白质分析、分子量、衣壳蛋白）；物理特性（颗粒大小、病毒颗粒聚糖化学修饰）；一级结构（序列确认、蛋白质鉴定）；先进的结构（镜头电子显微镜、分析超速离心）；生物活性（感染性颗粒、比活性、效价）等。EMEA审查结论是，由于细胞收获液中含有大量感染性杆状病毒，且下游工艺无法提供足够的病毒去除效果，因此要求申请人提供补充说明临床注射杆状病毒残留DNA风险分析报告并建议产品发布。检测项目中增加了传染性杆状病毒残留和rcAVV。而且，EMEA审查建议产品上市后的生产过程中应进一步增加杆状病毒去除工序（如病毒过滤），杂质（包装细胞DNA、残留Rep/Cap基因、rcAAV、感染性杆状病毒等）应去除。后期会增加。检测方法的灵敏度[30,31]。

3.2

（-rzyl，SPK-RPE65）是美国Spark公司开发的携带人RPE65基因的rAAV-2基因治疗产品。临床上用于通过视网膜下注射治疗先天性黑蒙。该产品采用三种质粒共转染贴壁细胞和滚瓶生产工艺。生产流程包括：细胞扩增、转染、培养基更换、收获培养基、切向流过滤、匀浆、离子交换层析、密度梯度离心、制备缓冲液更换及过滤等；本产品Ш期临床试验前发生了场地、包装容器等工艺变更，采用“Side-by-side”法对产品质量进行比较，进行产品可比性研究。产品放行检测项目包括：理化（外观、pH值、浓度、可提取量）、鉴定（目的基因）、含量（基因组浓度）、效价（目的基因表达量、体外活性）、纯度和安全性项目（内毒素） 、颗粒物、无菌）等。在质量研究中，对宿主DNA、质粒DNA、E1A基因、牛血清白蛋白等与工艺相关的杂质残留进行控制。 FDA审查认为，该产品上市后，应继续完成包装细胞稳定性和产品实时稳定性的研究[24,32]。

3.3

（AVXS-101）是该公司研发的rAAV9型基因治疗产品，携带运动神经元蛋白1（motor，SMN）基因。临床上用于静脉注射治疗儿童脊髓性肌萎缩症。在该产品的工艺开发过程中，根据目标质量属性，采用风险评估方法确定该产品的关键质量属性，并采用工艺规模缩减模型确定工艺设计空间并进行工艺验证；该产品在进行关键临床试验之前以及注册和上市之前进行了评估。 ，场地、工艺、制剂配方均发生了变化。 FDA审查并确定工艺变更前后产品纯度和VG单位效价保持一致；该产品的“效价”检测项目既包括靶细胞中SMN蛋白表达水平的定量检测，又包括小鼠“存活率”的体内半定量检测。值得注意的是，由于该产品І期临床试验时“含量”分析方法缺乏精密度和准确性，44个月后采用更新方法重新修正临床剂量。此外，在该产品的稳定性实验中，观察到“含量”和“效价”的下降[33]。

4 结论

目前，rAAV作为国际上日益成熟的外源基因导入平台技术。通过病毒外壳蛋白的化学修饰或定向进化等技术，提高载体靶向和感染效率，降低体内免疫原性[3]。由于rAAV产品在治疗单基因遗传病方面具有无可比拟的临床优势，科学界普遍认为基因治疗时代已经真正进入临床[6,34]。与此同时，基因治疗的国际监管趋势正在发生变化。 FDA和NIH在《新英格兰医学杂志》上联合发表文章指出，没有足够的数据证明基因治疗存在特殊且不可预测的安全风险。未来，美国将逐步简化监管程序，鼓励基因疗法的发展[35]。我国基因及细胞产品的监管科学研究长期以来相对滞后[36]。 2019年，国家药品监督管理局启动“细胞与基因治疗产品技术评价与监管体系研究”项目，针对rAAV等基因治疗产品技术评价要点开展相关研究。本文结合rAAV产品的最新研究进展和综述案例，探讨该类产品的药学研究内容和评价要点，以期为该类产品在我国作为“药品”的注册申请提供参考。